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表达谱系的分析
 

1、5’RACE克隆miRNA转录起始位点:

特点:

(1)应用“去帽法”原理,可以有效的扩增cDNA 5’末端全长序列;

(2)采用巢式PCR法,提高了5’ RACE的灵敏度和特异性,对低丰度的基因或极少量的RNA样品同样可以进行5′RACE实验;

(3)采用扩增性能优越的反转录酶,使长片段的RT-PCR扩增成为可能;

(4)一次反应可研究多个基因。

2启动子的克隆与系列缺失突变分析:

    一般认为miRNAs的编码基因由Ⅱ型启动子转录,能够采用经典的Ⅱ型启动子的分析技术进行分析。Luciferase reporter的构建是一种必备的研究手段:将转录起始位点附近的序列进行系列缺失后克隆到Luciferase报告载体上,进行启动子活性分析。莱德尔公司依托Promega的核心技术,提供高品质的技术服务。

特点:

(1)所采用的Luciferase双萤光报告系统,可以获得宽泛的线性定量范围与极高的灵敏度;

(1)采用瞬时转染技术,操作简便、快速,周期短,适用于绝大多数细胞类型。

3、EMSA :
特点:
    能够快速验证转录因子与miRNAs启动子的结合状况,并可以对数百个碱基的片段进行结合位点的扫描筛选,但只能检测细胞外的结合情况,需要其它手段的辅助验证。优化反应与电泳条件是增加准确率的关键所在,同时Supershift条带的形成,需要较高的抗体质量与优化的反应条件。
4、基因表达调控解析之利器—ChIP-qPCR:
特点:
(1)在靶基因的启动子上找到转录因子结合的直接证据,是细胞内真实的、原位的、一手的结果,具有更强的说服力;
(2)高通量,可得到与某一特定转录因子相关的所有作用位点;
(3)采用实时定量PCR检测,具有更高的精确度;
(4)一次反应可以得到与所研究转录因子相结合的所有片段库,可进行多方面研究。

 

 
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